Древнейшей иконой Никольского иконостаса, дошедшей до нашего времени, является входивший в состав местного чина образ Богоматери Умиление третьей четверти XV в.
Во второй половине XVI столетия иконостас Николо-Дворищенского собора был полностью реконструирован, свидетельством чего являются иконы деисуса и «Сретение» из праздничного ряда. В соответствии с новейшими требованиями того времени, он стал пятиярусным и включил в свой состав помимо местного, деисусного, праздничного и пророческого рядов также и праотеческий чин. Вероятно, в конце XVI в. в иконостасе появился «местный окладной образ» - храмовая икона св. Николая на круглой доске в серебряном басменном окладе; в 1886 г. для нее была изготовлена двусторонняя чеканная серебряная риза.
В 1679 г. иконостас Никольского собора пострадал от сильного пожара и был восстановлен в более скромном виде – как четырехъярусный, без праотеческого чина. В 1682-1683 гг. неизвестные новгородские мастера «праздники господские и богородичные все написали и поставили», а 1684 г. «иконописцы тое же церкви дьячок Василий Макарьев да Козьма Немкин» были наняты «писать пророки вновь на сборные деньги».
Свой окончательный вид с богатой, вызолоченной по полименту резьбой в стиле «второго барокко», Никольский иконостас приобрел в середине XIX столетия.
В годы Великой Отечественной войны нижний ярус иконостаса был почти полностью разобран солдатами испанской Голубой дивизии и использован на растопку. Погибли ценные иконы, царские врата и множество резных деталей иконостаса.
Реставрация большей части икон Никольского иконостаса была проведена в 1970-1980-е гг. в Межобластной специальной научно-реставрационной мастерской объединения «Росреставрация» бригадой под руководством Е.М. Кристи. В 2000-2013 гг. в Межобластном научно-реставрационном художественном управлении бригадой под руководством Д.В. Сарабьянова были реставрированы 9 икон деисусного чина; там же в настоящее время ведутся работы по раскрытию 10 икон пророческого чина.